Manuelle Patch-Clamp-Technik
Die manuelle Patch-Clamp-Technik (MPC) wurde 1976 von Erwin Neher und Bert Sakmann entwickelt und 1991 mit dem Nobelpreis ausgezeichnet. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Aufzeichnung elektrischer Ereignisse einzelner Zellen und hat unser Verständnis der Kardio- und Neurophysiologie revolutioniert.
Kultivierte Zellen oder ex vivo Gewebepräparationen werden in einer Aufzeichnungskammer perfundiert, die an ein Mikroskop angeschlossen ist. Dadurch kann der Anwender gezielt Zellen von Interesse visuell auswählen. Glasmikroelektroden werden an der Zellmembran positioniert, und durch Sog wird eine elektrisch dichte Versiegelung erzeugt. Summierte elektrische Ereignisse können in einer Zell-Anheftungs- oder Ganzzellkonfiguration (Abbildung 1) aufgezeichnet werden, oder es können kleine Membranbereiche isoliert und einzelne Ionenkanalereignisse registriert werden (Outside- oder Inside-Out-Konfigurationen).
Abbildung 1 – Beispielhafte Zeitverläufe und dazugehörige Kurven/Kanäle (Einblendungen), aufgezeichnet von Zellen mit stabiler Expression der hERG– (A, Maßstabsbalken 500 pA, 500 ms) oder CaV2.2-Kanäle (B, Maßstabsbalken 500 pA, 20 ms).
Ein wesentlicher Nachteil der MPC ist ihr geringer Durchsatz, wodurch sie sich weniger für das schnelle Screening großer Substanzmengen eignet. Daher wurden automatisierte Patch-Clamp (APC)-Geräte entwickelt, die MPC weitgehend als bevorzugte Methode für das Screening von Ionenkanälen ersetzt haben. Trotz dieser Entwicklung bietet die MPC einige Vorteile, darunter:
- Untersuchung der Phänotypen fluoreszenzmarkierter Transgene (Abbildung 2).
- Einzelkanalaufzeichnungen.
- GLP-Studien.
- Entwicklung von Assays.
- Bewertung der intrazellulären Wirkung von Verbindungen mit geringen Volumina.
Abbildung 2– Ganzzell-MPC-Aufzeichnung einer fluoreszenzmarkierten Zelle (gekennzeichnet durch den weißen Pfeil). ApconiX bietet sowohl MPC als auch APC für maßgeschneiderte Studien, die auf die Bedürfnisse unserer Kunden zugeschnitten sind
Messung der Erholung von Blockaden in spannungsgesteuerten Natriumkanälen und Vaughan-Williams-Klassifikation
Diagramm zur Darstellung der Erholung von der Natriumkanalblockade, 30 µM Mexiletin.
Das Verständnis von Herzrhythmusstörungen ist für die Arzneimittelforschung von entscheidender Bedeutung. Jahrzehntelange Forschung hat unser Wissen über die Rolle des hERG-Kaliumkanals bei der QT-Verlängerung erweitert. Teststrategien wurden optimiert, um Risiken durch Leitstrukturoptimierung zu minimieren (Pollard et al., 2008). Jüngst hat das CiPA-Paradigma den Fokus auf eine breitere Palette kardialer Ionenkanäle erweitert und kombiniert in silico-Modellierung mit Studien an menschlichen Kardiomyozyten zur Bestimmung des proarrhythmischen Risikos (Gintant et al., 2016).
Darüber hinaus interessiert sich die US FDA zunehmend für die funktionellen Konsequenzen der Blockade kardialer Natriumkanäle. Sie fordert nun Studien zur Erholung von Blockaden und zur Klassifikation von Arzneistoffen nach dem Vaughan-Williams-Schema (Lei et al., 2018).
In unserem Labor können wir die Erholung von Blockaden mittels automatisierter Patch-Clamp-Techniken messen. Die Testsubstanz wird zusammen mit Quinidin, Mexiletin und Flecainid untersucht, die jeweils schnelle, mittlere und langsame Erholungskinetiken zeigen.
Die Experimente werden bei nahezu physiologischer Temperatur durchgeführt. Diese Studien sind nicht GLP-konform, können jedoch für behördliche Einreichungen genutzt werden.
Nachhaltigkeit bei ApconiX
Als umweltbewusstes Unternehmen suchen wir kontinuierlich nach Wegen, Nachhaltigkeit in den Laboralltag zu integrieren und Kunststoffabfälle zu reduzieren. Jährlich erzeugen die Verbrauchsmaterialien und Geräte, die für die Zellkultur benötigt werden, Tonnen von Plastikmüll, der weder wiederverwendet noch recycelt werden kann. Dies stellt eine langjährige Herausforderung dar, die sowohl die Umwelt belastet als auch die Betriebskosten erhöht.
Bis 2022 produzierte unsere Zellkultursparte durchschnittlich 80 kg Plastikabfall pro Monat. Da viele Recyclinganlagen Laborabfälle aufgrund von Kontaminationsrisiken nicht akzeptieren, sind alternative Lösungen erforderlich.
In den letzten sechs Monaten haben wir eine Studie durchgeführt, in der wir gebrauchsfertige Zelllinien anstelle der kontinuierlichen Zellkultur entwickelt haben. Diese Methode spart nicht nur Zeit, sondern reduziert auch den Kunststoffverbrauch im Vergleich zu traditionellen Zellkulturmethoden. Die Zellen werden bei hoher Lebensfähigkeit eingefroren und können direkt nach dem Auftauen für Patch-Clamp-Assays verwendet werden, ohne dass eine Kultivierung oder Passage erforderlich ist. Die ersten Ergebnisse zeigen, dass diese Zellen eine exzellente Lebensfähigkeit und funktionelle Aktivität aufweisen, die mit lebenden, kultivierten Zellen vergleichbar ist.
Reduktion der Nutzung von fetalem Kälberserum in der Zellkultur
Fetales Kälberserum (FBS) ist der flüssige Anteil des Blutes von Rinderföten und wird häufig als Zusatz in Zellkulturmedien verwendet. Es enthält zahlreiche Komponenten, die das Zellwachstum und die Zellanhaftung fördern. Allerdings ist seine genaue Zusammensetzung nicht definiert, was zu wissenschaftlichen Herausforderungen führt. Beispielsweise kann die Zusammensetzung zwischen Chargen variieren und experimentelle Ergebnisse beeinflussen. Zudem bestehen ethische Bedenken hinsichtlich der Blutgewinnung von Föten, da dieser Prozess mit Schmerz und Unbehagen für das Tier verbunden sein kann. Auch finanziell ist die Nutzung von FBS problematisch, da die hohe Nachfrage bei schwankendem Angebot die Preise in den letzten Jahren um mehr als 300 % steigen ließ.
Unsere Experimente zielten darauf ab, unsere Zelllinien an serumreduzierte Bedingungen anzupassen. Hierfür wurde unsere hERG-CHO-Zelllinie in Medien mit unterschiedlichen FBS-Konzentrationen kultiviert und ihre Leistung mittels automatisierter Patch-Clamp-Analysen bewertet. Wir fanden heraus, dass eine Reduktion von 10 % auf 2 % die erfolgreichste Anpassung ermöglichte. Derzeit optimieren wir diesen Ansatz weiter, um eine nachhaltigere und ethisch verantwortungsbewusstere Zellkultur zu etablieren.