Aptitudes supplémentaires

Including assay development, manual patch clamp, sustainability and investigative research.

Patch-Clamp manuel

Le patch-clamp manuel (PCM) a été inventé par Erwin Neher et Bert Sackman en 1976 et a reçu un prix Nobel en 1991. Facilitant l’enregistrement d’évènements électriques dans des cellules isolées en temps réel, le PCM fournit une technique puissante et polyvalente qui a révolutionné notre compréhension de la cardio- et neurophysiologie.

Des cellules cultivées ou des préparations de tissus ex vivo sont perfusées dans une chambre d’enregistrement attachée à un microscope, permettant à l’utilisateur de sélectionner visuellement les cellules d’intérêt. Des microélectrodes en verres sont positionnées sur la membrane cellulaire et une aspiration est appliquée pour former un joint électriquement étanche. La somme des évènements électriques peut être enregistrée en configuration cellule attachée ou cellule entière (Figure 1), ou bien de petites portions de membrane peuvent être isolées et les évènements d’un seul canal ionique sont enregistrés (configuration « outside-out » ou « inside-out »).

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Figure 1 – Exemple de graphes de mesure du courant en fonction du temps et traces correspondantes (insérées) enregistrées sur des cellules exprimant stablement le canal ionique hERG (A ; échelle 500pA, 500ms) ou CaV2.2 (B ; échelle 500pA, 20ms).

Un inconvénient majeur du patch-clamp manuel est que son faible débit ne permet pas de cribler rapidement un grand nombre de composés. Des machines de patch-clamp automatisé ont ainsi été développées et ont largement remplacé le patch-clamp manuel comme technique de référence pour le criblage de canaux ioniques. Malgré cela, le PCM garde de nombreux avantages, par exemple :

  • L’étude des phénotypes de transgènes avec un tag fluorescent (Figure 2)
  • L’enregistrement de canaux isolés
  • Les études BPL
  • Le développement d’essai
  • L’évaluation d’actions intracellulaires de composés en faible volume.
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Figure 2– Enregistrement de PCM en cellule entière d’une cellule marquée par fluorescence (indiqué par une flèche blanche).
ApconiX offre du patch-clamp manuel et automatisé pour des études personnalisées aux besoins de nos clients.

Mesure de rétablissement du courant après blocage de canaux sodiques voltage-dépendants et classification Vaughan-Williams

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Graphe montrant le rétablissement du courant sodique après blocage du canal, 30uM de mexiletine.

La compréhension des arythmies cardiaques est essentielle au développement de médicaments. Des décennies d’études ont améliorés notre compréhension du rôle du canal potassique hERG dans la prolongation de l’onde QT, et les stratégies de tests ont évolués pour identifier et réduire les risques par « lead optimisation » (Pollard et al., 2018). Plus récemment, le paradigme CiPA a élargi le champ d’action à un panel plus large de canaux ioniques cardiaques, associé à de la modélisation in silico et des études sur cardiomyocytes humains pour définir le risque pro-arythmique (Gintant et al., 2016).

Au-delà de cela, la FDA s’intéresse de plus en plus aux conséquences fonctionnelles du blocage du canal sodique cardiaque. Elle demande désormais des études pour définir le rétablissement après blocage et pouvoir classer les médicaments selon le schéma de Vaughan-Williams (Lei et al., 2018).

Dans notre laboratoire, nous sommes en mesure d’évaluer le rétablissement du courant après blocage, par patch-clamp automatisé. Le composé est étudié aux côtés de la quinidine, la mexiletine et la flécaïnide, qui présentent des cinétiques de rétablissement rapide, moyenne et lente, respectivement.

Les expériences sont réalisées à une température proche de celle physiologique. Ces études ne sont pas conformes aux BPL mais peuvent être utilisées à des fins de soumission réglementaire.

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Développement durable à ApconiX

En tant qu’entreprise soucieuse de l’environnement, nous cherchons constamment des moyens d’intégrer la durabilité au travail quotidien en laboratoire et de réduire les déchets plastiques là où nous le pouvons. Chaque année, les consommables et équipements nécessaires à la culture cellulaire quotidienne génèrent des tonnes de déchets plastiques, qui ne peuvent être ni ré-utilisés ni recyclés. Il s’agit d’un problème de longue date qui a un impact sur l’environnement en augmentant les déchets plastiques envoyés dans les décharges et qui augmente le coût de fonctionnement d’un laboratoire. Notre travail de criblage de canaux ioniques signifie que notre laboratoire s’appuie fortement sur des plastiques à usage unique dans nos opérations quotidiennes, ce qui entraîne un coût financier et environnemental et contribue à notre empreinte carbone.

Il a été estimé que jusqu’en 2022, notre département de culture cellulaire générerait chaque mois en moyenne 80 kg de consommables et de déchets plastiques, sans compter que la plupart des usines de recyclage n’acceptent pas les déchets plastiques des laboratoires en raison de leur contamination.

Au premier semestre de 2022, nous avons mené une étude dans laquelle nous avons généré des lignées cellulaires prêtes à l’emploi au lieu d’une culture cellulaire continue, ce qui a été reconnu comme un gain de temps et réduisant la quantité de déchets plastiques générés par rapport aux méthodes de culture cellulaire traditionnelles. Ce sont des cellules congelées à haute viabilité, les rendant adaptées au criblage de sécurité du médicament, et pouvant être utilisées dans des essais de patch-clamp directement après décongélation, sans culture ni passage. Les cellules prêtes à l’emploi ont montré une excellente viabilité et une activité fonctionnelle comparable aux cellules vivantes cultivées après des tests de dose-réponse.

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Improved Sustainability Through the Use of Assay Ready Cells to Support Ion Channel Screening

Réduire l’utilisation de sérum fœtal bovin en culture cellulaire

Le sérum fœtal bovin (« Foetal Bovine Serum », FBS) est une fraction liquide de sang prélevé sur les fœtus bovins. Il est couramment utilisé comme supplément dans les milieux de culture cellulaire car il contient des milliers de composants propices à l’attachement, la croissance et au maintien des cellules. Cependant, la composition spécifique du FBS est en grande partie inconnue, ce qui a conduit à plusieurs problèmes scientifiques. Par exemple, le FBS peut varier d’un lot à l’autre (affectant la variabilité expérimentale) et contenir des facteurs défavorables (soulevant des problèmes de biosécurité). Il existe également des préoccupations éthiques autour de la pratique du prélèvement de sang fœtal, car elle expose le fœtus à des douleurs et à des inconforts. D’un point de vue financier, la demande et l’offre instable de FBS ont entrainés une hausse des prix de plus de 300 % ces dernières années, ce qui en fait un facteur de coût important des milieux de culture cellulaire. Il serait scientifiquement, éthiquement et financièrement avantageux d’utiliser une alternative synthétique chimiquement définie, mais il reste encore à développer un milieu sans sérum avec une efficacité comparable. Nos expériences visaient à adapter nos lignées cellulaires à des conditions de sérum réduit en utilisant des milieux et des suppléments disponibles dans le commerce.

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La réduction de FBS a été étudiée en utilisant notre lignée cellulaire hERG CHO. Les cellules ont été cultivées avec plusieurs pourcentages de FBS et leurs performances ont été mesurées par patch-clamp automatisé (figure 1). Nous avons conclu qu’une réduction de 10% à 2% était la transition avec le plus de succès. Continuant nos efforts pour optimiser et valider leurs performances dans cet essai, le laboratoire a hâte de continuer à œuvrer pour une approche plus éthique et durable de la culture cellulaire.

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